HPLC的梯度洗脱
发布日期：2014-07-08
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HPLC的梯度洗脱类似于GC的程序升温。程序升温是GC在分析过程中不断改变温度，而HPLC的梯度洗脱是在分析过程中不断改变流动相的组成。录用等度（一种流动相）洗脱分离一组组分时，每一个峰的值小于最后一个峰的1/30时，可考虑用梯度洗脱方法。
一组氯代苯同系物，若用等度洗脱，最后一组分的色谱峰值＞第一个组分的色谱峰值30倍，选用梯度洗脱，所有组分谱峰的峰宽基本相等，缩小了值的差异，缩短了分析时间。
梯度洗脱用两种以上的流动相，而且是在仪器运转过程中在线混合，必须由特殊的泵件和混合装置进行有效的混合。
1、低压混合
这种装置是由几种不同的流动相由控制器按不同的比例打入低压混合中混合后再由泵打入柱内。要求控制器准确、及时将不同的流动相打入低压混合器中进行有效的混合。
2、高压混合
高压混合从两个以上的高压泵中按比例流出的流动相的混合器中混合。流动相组成比例取决于每个泵的相对流速。高压混合装置可使流动相不需脱气泡的影响小。
3、高低压混合
这种装置利用低压比例阀加高压混合，仅需一个泵，流动相不需脱气。流动相1由高压泵打进，流动相2由压差重力作用流入混合室中。控制阀A、B、C主要是排空、放气，并能适当调节两流动的比例。比例阀D、E控制两流动相最后进入混合室的比例。
以二元梯度的反相色谱为例，一般先用大比例的弱溶剂（水），而后不断增大强溶剂（甲醇、乙腈）的比例，减小弱溶剂的比例。弱保留分先离开色谱术，然后由弱保留组分到强保留组分被逐步洗脱下来。因流动相的强度不断变化，相当于无数个等度洗脱组成了梯度洗脱。所以梯度洗脱的色谱峰的半宽和相对的值基本相等。
分离检测人血中16种氨基酸用反相色谱梯度洗脱，C18，氨基酸被衍生化后柴紫外检测器检测。流动相A为四氢呋喃-甲醇-0.1mol/L乙酸钠（pH7.2）=5：95：900；流动相B 为甲醇。
流速为0.40mL/min,柱温为40℃。本方法有效地分离了16种氨基酸，最小检知量为15.0umol/L，线性范围17.0～1000.0umol/L，各氨基酸的相关系数R≈0.998，回收率为89%～95%，RSD＜7.0%。
用反相HPLC等度洗脱方法对喹诺酮抗生素帕珠沙星合成产物做质量控制。弱溶剂配制的流动相，帕珠沙星为45min色谱峰挤在一起，无法定量。改用数种HPLC等度洗脱方法，结果都不理想。用梯度洗脱方很容易解决了问题。
在梯度洗脱时开始的流动相中强溶剂的比例不能太大，否则前面的色谱峰挤在一起。
两个梯度之间必须有一个过渡平衡时间，如分析氨基酸时，从31min到32min为平衡时间。平衡时间不足，相连的两个样品色谱峰的保留时间就不一样，这是因为前一个梯度的流动相滞留影响了后一个流动相的组成。
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